血清学检查(参考件)

B1　血清学检查有助于流行病学追溯诊断，检查抗体的成分为抗菌抗体。为进行血清学诊断，需要采取病人的双份血清，在发病第1～3天采第一份血清，第15～20天采第二份血清。检查血清中抗菌抗体常用凝集试验和杀弧菌试验，杀弧菌试验比凝集试验敏感。

B2　试管凝集试验：用生理盐水对倍连续稀释待检血清，每管含稀释血清0.5mL。将标准菌在营养琼脂上的16～18h培养物用0.2％福尔马林生理盐水制成约含18亿菌/mL(相当于细菌标准比浊管浓度)的悬液，每稀释血清管加0.5mL；另将菌悬液加入0.5mL生理盐水中作对照。摇匀，置37C3h观察初步结果，再放冰箱

(4℃)或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能使菌凝于管底成伞状，上清半透明者判为＋＋，以能使菌呈＋＋凝集的血清最高稀释度判为血清凝集效价。第二份血清效价比第一份血清增长4倍或以上者有诊断意义。

B3　杀弧菌抗体检测：可采用改良微量法，检测程序如下：

a.　2，3，5－氯化三苯四氮唑溶液(TTC)的配制：用无菌蒸馏水配制0.5％(W/V)溶液，加热溶解，置灭菌棕色瓶中，4℃保存备用。

b.　补体指示菌混悬液制备：选取标准01群及0139群霍乱弧菌为指示菌，分别连续在营养琼脂平板上分离2次，选取光滑型菌落2～3个，挑取小量接种于5mL营养肉汤中，37℃培养6h，取0.1mL转种于5mL营养肉汤，37℃培养2h，用分光光度计测定492nm吸光度(OD)值，调整OD值至0.1为原液。将原液作1∶50稀释后与1∶10补体等量混合，即为补体指示菌混悬液。

c.　待检血清稀释：于经洗涤处理、无水乙醇浸泡5min和紫外灯照射灭菌1h的微量培养板或4×10孔聚苯乙烯塑料板用微量加液滴管每孔加入一滴(0.025mL)灭菌磷酸盐缓冲盐水PBS或生理盐水，再将待测灭活血清一滴(0.025mL)加入每排的第1孔，自第1孔开始作连续对倍稀释至第10孔。

d.　加补体指示菌悬液：于每孔稀释血清加入补体指示菌悬液一滴，加盖，在微型振荡器上振荡1～2min，置37℃水浴箱孵育30min。

e.　加TTC营养肉汤：每孔加入含0.01％TTC的营养肉汤0.15mL(2大滴)，混匀后，继续置37℃水浴箱孵育4h。

f.　观察结果：以孔内无颜色变化的血清最高稀释度为被检测标本的杀弧菌抗体滴度，第二份血清效价比第一份血清升高8倍或以上者有诊断意义。